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蛋白純化常見(jiàn)問(wèn)題（二）

那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下蛋白純化常見(jiàn)問(wèn)題（二）。
Q：Superdex 75( 球蛋白分離范圍 3 – 70 KDA)， Superdex 200 (10 – 600 KDA) 和 Superose 6(5-5000 KDA)，分離范圍有重疊，如何選擇？
A：一般使待分離樣品的分子量位于線性分離范圍中部。根據(jù)分子量 Marker 在三種柱子上的表現(xiàn)，三者常規(guī)推薦：蛋白分子量在 40 kDa 以下 (3 kDa 以上 ) 考慮使用 Superdex 75；40 – 400 kDa的樣品考慮使用 Superdex 200；分離 400 kDa 以上樣品時(shí)，建議選擇 Superose 6 Increase。

Q：脫鹽實(shí)驗(yàn)中的緩沖液如何選擇？
A：如果我們用緩沖液 A 來(lái)平衡柱子，上樣后，走外水的樣品其實(shí)是跟著平衡時(shí)的緩沖液 A 出峰并溶解在其中的（而非*后趕樣品用的洗脫緩沖液）。因此，希望樣品溶解在緩沖液 A 中，就用緩沖液 A 來(lái)平衡柱子。緩沖液的選擇，依據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和填料本身耐受性，同時(shí)確保樣品在該緩沖液中穩(wěn)定存在。通常，使用 10-50 mM 磷酸鈉緩沖液，至少含有 25 mM NaCl 用于避免離子作用的非特異性吸附，中性 pH 7.0 ~ 7.4。或揮發(fā)性緩沖液如 100 mM 乙酸銨或碳酸氫銨。

Q：純化得到的組分中沒(méi)有或很少目的 His 標(biāo)簽蛋白，怎么回事？
A：若目的 His 標(biāo)簽蛋白正常表達(dá)（使用抗 His 標(biāo)簽的抗體進(jìn)行 WB 檢測(cè)）且充分釋放至上清中，確認(rèn)蛋白是流穿還是未被洗脫：
若 His 標(biāo)簽蛋白流穿：
樣品或結(jié)合緩沖液的條件不合適，注意螯合劑或強(qiáng)還原劑以及咪唑的濃度。
His 標(biāo)簽蛋白與填料的結(jié)合較弱：降低上樣流速或增加孵育時(shí)間；增加標(biāo)簽 His 的數(shù)量（常用 6 – 10 個(gè)）。
His 標(biāo)簽未充分暴露：在變性條件（4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 鹽酸胍）下進(jìn)行純化或測(cè)試；重新構(gòu)建克隆，改變 His 標(biāo)簽的位置。
嘗試其他的金屬離子：如鋅離子，鈷離子等。
若 His 標(biāo)簽蛋白未洗脫：
洗脫條件過(guò)于溫和：增加咪唑濃度或降低洗脫 pH（注意：pH降至 4.0 以下時(shí) Ni2+ 會(huì)發(fā)生脫落）。
目的蛋白與填料發(fā)生非特異性疏水或其他相互作用：在洗脫緩沖液中加入非離子型去垢劑（如 2% Triton X-100）或提高 NaCl濃度。
目的蛋白在填料中發(fā)生了沉淀：減少上樣量；使用咪唑線性梯度而不是步級(jí)洗脫以降低洗脫得到的蛋白濃度；使用去垢劑或改變 NaCl 濃度；在變性條件 (4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 鹽酸胍 )下洗脫。

以上就是上海金鵬分析儀器有限公司為大家整理總結(jié)關(guān)于蛋白純化常見(jiàn)問(wèn)題（二）。
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蛋白純化常見(jiàn)問(wèn)題（二）